.RU
Карта сайта

Качественная ПЦР - Клинические аспекты лабораторной диагностики вич-инфекции


^ Качественная ПЦР

проводится с целью определения ДНК ВИЧ в лимфоцитах крови для установления ВИЧ-статуса пациента.
Порог чувствительности выявления ДНК ВИЧ методом качественной ПЦР составляет около 5 копий на 106 клеток. Метод тем не менее считается несколько менее точным для диагностики ВИЧ-инфекции, чем ИФА/ИБ, и используется в следующих случаях:
1) когда использование ИФА/ИБ для установления ВИЧ-статуса некорректно:

2) для уточнения неопределенных результатов тестирования в ИФА/ИБ.
Для постановки качественной ПЦР с целью установления ВИЧ-статуса ребенка, рожденного ВИЧ-позитивной матерью, не используют пуповинную кровь, так как она может содержать материнскую кровь, а исследуют только кровь ребенка.
Положительный результат ПЦР-определения ДНК ВИЧ в первые 48 часов жизни ребенка позволяет предположить внутриутробное заражение. Вероятность обнаружения ДНК ВИЧ в первые 48 часов жизни ребенка составляет всего 17-38%. Если на первой неделе жизни ПЦР-определение ДНК ВИЧ дает отрицательный результат, а впоследствии – положительный, то считается, что заражение ребенка произошло во время родов. К возрасту 1 месяца ДНК ВИЧ обнаруживается практически у всех инфицированных детей: чувствительность составляет 98%, а специфичность – 99%.
Для постановки диагноза ВИЧ-инфекции ребенку, рожденному ВИЧ-позитивной матерью, обычно проводится двукратное ПЦР-исследование с интервалом 2-3 месяца. Получение отрицательного результата свидетельствует об отсутствии ВИЧ-инфекции, но требует подтверждения путем параллельного получения отрицательного результата в ИФА/ ИБ.

^ Вирусная нагрузка (ВН, англ. – VL), или количественная ПЦР,

проводится с целью определения количества вирусов (РНК ВИЧ) в плазме крови пациента.
Определение вирусной нагрузки имеет значение для:

Характеристика используемых для измерения уровня вирусной нагрузки тест-систем представлена в табл. 4.
Таблица 4 – Тест-системы для измерения уровня вирусной нагрузки, одобренные FDA [цит. по Дж. Бартлетту, 2006]

Торговое название

Amplicor


HIV Monitor 1.5



^ Versant


HIV-1 RNA3.0



NucliSens


HIV-1 QT



Производитель

Roche

Bayer

bioMerieux

Техника

ОТ-ПЦР

рДНК

NASBA

Сравнение результатов

Результаты, получаемые методом ОТ-ПЦР, сравнимы с результатами, получаемыми методом рДНК (Versant) с использованием тест-систем 2.0 и 3.0

Результаты, получаемые методом рДНК, сравнимы с результатами, получаемыми методом ОТ-ПЦР (Amplicor)

Результаты, по-видимому, сравнимы с результатами, получаемыми методами ОТ-ПЦР и рДНК, но пока не получе­но достаточно данных

Преимущества / недостатки

• Меньше ложноположительных результатов у ВИЧ-отрицательных пациентов по сравнению с тест-системами фирмы Bayer.

• Занимает меньше времени.
• Хороший динамический диапазон, но выше порог неопределяемой вирусной нагрузки.

• Может применяться для обнару­жения вируса в тканях и биологи­ческих жидкостях, например, выделениях половых путей.
• Самый большой динамический диапазон.

Динамический диапазон

• Стандартный: (Amplicor 1.5) 400-750 000 копий/мл
• Суперчувствительный: (Ultra-Direct 1.5) 50-100 000 копий/мл

рДНК 3.0: 75-500 000 копий/мл*

Количественный тест на ВИЧ-1 NucliSens: 176-3 500 000 копий/мл; динами­ческий диапазон зависит от объема

Подтип вируса

Тест-система 1.5: от А до G

от А до G

от А до G

Необходимый объем материала для исследования

• Amplicor: 0,2 мл
• Суперчувствительный: 0,5 мл

1 мл

От 10 мкл до 2 мл

Пробирки

ЭДТА (пробирка с сиреневой крышкой)

ЭДТА (пробирка с сиреневой крышкой)

ЭДТА, гепарин, цельная кровь, лю­бая биологическая жидкость, МКПК, семенная жидкость, ткани и т. д.

Требования

Отделить плазму не позже чем через 6 часов после забора крови, перед транспорти­ровкой заморозить при температуре -20°С или -70°С.

Отделить плазму не позже чем через 4 часа после забора крови, перед транспортировкой заморозить при темпера­туре -20°С или -70°С.

Отделить сыворотку или плазму не позже чем через 4 часа после забора крови, перед транспорти­ровкой заморозить при температуре -20°С или -70°С.

* нижний порог измерений, установленный FDA, равен 50 копий/мл
Используемые для определения вирусной нагрузки тесты обычно определяют наличие РНК ВИЧ-1 субтипов В или А-G (группа М). Тесты недостаточно точны для выявления ВИЧ-1 групп N или О, а также ВИЧ-2.
Вирусная нагрузка определяется обычно в плазме крови, но некоторыми тестами ее можно определять и в других биологических жидкостях, например, в семенной жидкости, вагинальных выделениях, спинномозговой жидкости, грудном молоке, слюне.
Диапазон определяемых значений вирусной нагрузки различен для разных тест-систем. Минимальный порог определения для используемых в настоящее время в Беларуси тестов составляет 1 500 копий/мл, то есть термин «неопределяемая вирусная нагрузка» не означает отсутствия вируса в крови, а говорит о том, что его количество составляет менее порога определения для данной тест-системы (в нашем случае < 1 500 копий/мл).
Чувствительность теста составляет около 100% при острой ВИЧ-инфекции; специфичность в среднем 97%, но при вирусной нагрузке >10 000 копий/мл приближается к 100%.
Специфичность теста составляет 91-98%, поэтому тест не используется для диагностики ВИЧ-инфекции. Ложноположительные результаты у неинфицированных пациентов регистрируются в 2-9%, обычно показывая низкую концентрацию вируса (<10 000 копий/мл). Диагноз ВИЧ-инфекции, выставленный при обнаружении РНК ВИЧ в крови, должен быть подтвержден стандартными тестами – постановкой качественной ПЦР (определение ДНК ВИЧ) или постановкой ИБ (с повтором ИБ спустя 2-4 месяца после начального сомнительного или отрицательного теста).
Приведенная в табл. 5 градация уровней вирусной нагрузки является в определенной степени условной, но позволяет выделять порог возможного старта прогрессирования ВИЧ-инфекции, при регистрации которого требуется дополнительная оценка клинического статуса и количества CD4 лимфоцитов для решения вопроса о начале АРТ. Вирусная нагрузка в пределах до 5 тысяч копий/мл говорит о низком риске прогрессирования ВИЧ, порог возможного старта прогрессирования составляет > 55 тысяч копий/мл для подростков и взрослых и > 100 тысяч копий/мл (или даже более высокие значения) для детей.
Таблица 5 – Условная градация уровней вирусной нагрузки

градация уровней

VL, копий/мл (методом RT-PCR)

порог определения



< 50 *


< 1 500 **



очень низкий уровень

1 500 - 7 тысяч

низкий уровень

7 - 20 тысяч

умеренный уровень

20 - 55 тысяч

порог возможного старта прогрессирования ВИЧ-инфекции



> 55 тысяч

у подростков и взрослых

> 100 тысяч

у детей

высокая вирусная нагрузка

> 80 - 100 тысяч

* порог определения, достигаемый при использовании некоторых тест-систем и принятый в клинических рекомендациях по оценке эффективности АРТ
** порог определения для используемых в настоящее время в Беларуси тест-систем
Вирусная нагрузка у мужчин на фоне сохранного иммунитета может быть несколько выше, чем у женщин (до 2 раз), но при снижении количества CD4 лимфоцитов (<300 клеток/мкл) эти различия исчезают. Поэтому при оценке уровня вирусной нагрузки при принятии лечения о начале АРТ пол пациента не учитывают.
Клиническая трактовка результатов определения вирусной нагрузки сложна, так как:

Поэтому при трактовке результатов определения вирусной нагрузки следует учитывать следующее:

Существуют особенности вирусной нагрузки у детей:

На основании уровня вирусной нагрузки нельзя судить о степени повреждения функции иммунной системы и о чувствительности вируса к АРВ препаратам.

^ 2.5 Определение количества CD4 лимфоцитов


Определение количества CD4 лимфоцитов проводится методом проточной цитофлюориметрии. Принцип метода:

Метод является дорогостоящим, стоимость одного исследования в Европе составляет около 50-100 €.
Результаты определения количества CD4 лимфоцитов позволяют судить о степени Т-клеточного иммунодефицита, что необходимо для:

Таблица 6 – Классификация иммуносупрессии по ВОЗ, 2006 г.

иммунологическая категория

CD4, % от лимфоцитов

^ CD4, копий/мл

≤ 12 месяцев

> 13 месяцев

≤ 1 года

1-5 лет

≥ 6 лет и взрослые

отсутствие значимой иммуносупрессии

30



25



³ 1500

³ 1000

500



легкая иммуносупрессия

25-29



20-24



1000-1500

750-1000

350-500



умеренная («продвинутая») иммуносупрессия

20-24



15-19



750-1000

500-750

200-350



выраженная иммуносупрессия

< 20



< 15



< 750

< 500

< 200


2014-07-19 18:44
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • © sanaalar.ru
    Образовательные документы для студентов.