.RU
Карта сайта

Выделение и характеристика гемолизина II bacillus cereus


На правах рукописи

Ковалевская Жанна Ивановна



Выделение и характеристика гемолизина II Bacillus cereus



03.00.03 – Молекулярная биология

Автореферат



диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

г. Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино, в лаборатории молекулярной физиологии клетки Института биофизики клетки РАН, г. Пущино.

Научные руководители

: кандидат биологических наук, старший научный

сотрудник, Солонин Александр Сергеевич, ИБФМ РАН

кандидат биологических наук,

Терновский Вадим Игоревич, ИБК РАН

Официальные оппоненты

: доктор физико-математических наук, профессор,

Харакоз Дмитрий Петрович, ИТЭБ РАН, г.Пущино

доктор биологических наук, профессор,

Азизбекян Рудольф Рубенович, ФГУП ГосНИИгенетика,

г. Москва

Ведущая организация

: Институт биоорганической химии РАН им. академиков

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва

Защита диссертации состоится 13 ноября 2007г. в 14:00 часов на заседании Диссертационного Совета Д217.013.01 при ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, 1. Факс: (495) 315-05-01.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП ГосНИИгенетика.

Автореферат разослан 11 октября 2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

кандидат биологических наук Заиграева Г. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ



Актуальность работы.

Одним из основных фундаментальных направлений современных микробиологии и медицины является изучение патогенности микроорганизмов. В настоящее время известно, что патогенные бактерии вырабатывают широкий спектр веществ, как непосредственно повреждающих или убивающих клетки макро- и микроорганизмов, так и способствующих проникновению бактерий в организм хозяина, вследствие преодоления его защитных систем. Эти соединения играют главную роль в развитии заболеваний, вызываемых бактериями (McDonel et al., 1986).

Среди многообразия таких веществ можно выделить цитолитические токсины, которые играют немаловажную роль в патогенезе. Характерными примерами токсинов являются такие цитолизины, как фосфолипаза С Clostridium perfringens - основной фактор, ответственный за развитие газовой гангрены, отёчный и летальный токсины Bacillus anthracis, обеспечивающие вирулентность, альфа-токсин Staphylococcus aureus, вызывающий целый ряд клинических эффектов при стафилококковых инфекциях и являющийся β-складчатым каналообразующим цитолизином.

Интерес к исследованиям β-складчатых каналообразующих токсинов не ограничивается лишь медицинской сферой. Изучение этих белков стимулируется и тем, что они стали ценными инструментами при исследовании клеточной физиологии и функционирования клеточных мембран и превосходными модельными объектами для выяснения связи между структурой и функцией белка. β-Складчатые каналообразующие цитолизины являются хорошей моделью в изучении белок-мембранного взаимодействия. В последнее время они нашли своё применение и в биотехнологии, в создании клетко-подобных биореакторов, что позволяет значительно увеличить экспрессию белков (Noireaux, 2004), а также в конструкции нанопор (Merzlyak, 2005) и биосенсоров (Gu, 2001). К β-складчатым каналообразующим токсинам относят ряд цитолизинов Staphylococcus aureus (-токсин, лейкоцидины, -гемолизин), -токсин Clostridium perfringens и CytK токсин B. cereus.

Изучение механизмов действия этих токсинов и их функции в патогенезе представляется одним из наиболее актуальных направлений в исследовании молекулярных основ патогенности и вирулентности микроорганизмов. Особый интерес вызывают токсины цереусной группы микроорганизмов рода Bacillus, в эту группу входят: B. anthracis, известный как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву; B. thuringiensis – являющийся патогенным для насекомых и широко использующимся для производства инсектицидных препаратов, что ведет к широкомасштабному внесению и неконтролируемому распространению этого микроорганизма в окружающей среде; B. cereus, который относится к условно-патогенным для теплокровных, но является одним из основных бактериальных загрязнителей продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. Эти микроорганизмы продуцируют ряд цитолитических белков, рассматриваемых в качестве потенциальных факторов патогенности. В связи с выше изложенным, важно определить степень безопасности этих микроорганизмов для животных и человека и изучить участие отдельных токсинов, продуцируемых этими бактериями в патогенном процессе.

B. cereus может вызывать диаррейный и эметический синдромы, а также заболевания глаз, маститы и другие болезни. Ряд внеклеточных токсинов B. cereus, обладают гемолитической активностью и рассматриваются в качестве потенциальных факторов патогенности (Drobniewski, 1993). Один из цитолитических порообразующих токсинов B. cereus – гемолизин II (HlyII) представляет особый интерес, так как он является гомологом такого опасного токсина, как альфа-токсин Staphylococcus aureus. Более того, он широко распространен среди бацилл цереусной группы, так как его ген обнаружен также в клетках B. thuringiensis, B. weihenstephanensis и B. anthracis.

К настоящему времени ряд гемолизинов B.cereus получен в очищенном состоянии и активно изучаются в самых разнообразных аспектах, тогда как гемолизин II до сих пор практически не изучен, поскольку не удавалось получить высокоочищенный препарат белка. Благодаря высокой гомологии с альфа-токсином есть основания считать, что гемолизин может играть немаловажную роль в патогенезе и поэтому требуется его всестороннее изучение. Данное обстоятельство определяет актуальность разработки метода очистки, получения гомогенного препарата белка и исследования его свойств.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось проведение структурно-функционального анализа гемолизина II Bacillus cereus.

Для достижения указанной цели решались следующие задачи:

  1. Подобрать оптимальные условия для максимальной экспрессии гена гемолизина II Bacillus cereus в клетках E. coli.

  2. Разработать метод очистки препарата HlyII.

  3. Определить роль сигнальной пептидазы в процессинге HlyII.

  4. Изучить механизм действия гемолизина II с использованием искусственных и клеточных мембран.

  5. Изучить свойства пор, формируемых гемолизином II в естественных и искусственных мембранах, механизм и условия порообразования.

  6. Изучить цитолитическое действие и влияние на макроорганизмы гемолизина II.

Данная работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН.

Научная новизна работы.

Впервые получен высокоочищенный препарат гемолизина II B. cereus, исследованы его свойства и определен механизм действия.

Практическое значение работы.

Результаты работы могут быть использованы в медицине, биотехнологии, сельском хозяйстве. Получение чистого препарата гемолизина II и изучение его структурно-функциональных особенностей даёт возможность для выяснения возможности его участия в патогенезе и поиска подходов для нейтрализации действия токсина. Препарат гемолизина II может быть использован в создании клетко-подобных биореакторов, что позволяет значительно увеличить экспрессию белков, а также в конструкции нанопор. Полученные результаты можно применять в нанотехнологии, конструировании мембранных пор с определёнными свойствами (с разной проводимостью, селективностью и т.д.). Такие поры могут быть употреблены как компоненты фильтров, биосенсоров и других наноустройств.

Тот факт, что гемолизин II широко распространен среди штаммов B. thuringiensis, применяемых как биологический инсектицид, заставляет усилить внимание к тщательному анализу используемых штаммов на предмет их безопасности для человека и животных, а также заостряет вопрос о правомочности использования данного микроорганизма в качестве инсектицидного препарата.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Результаты работы были представлены на 7-ой Пущинской конференции молодых ученых (Пущино, апрель 2003), на конференции ИБФМ РАН (Пущино, декабрь 2003), на международной конференции Gordon Research Conference (Andover, USA, 2004), на 3-ей международной конференции из серии “Наука и бизнес” (Пущино, июнь 2006), на 106-ой конференции American Society for Microbiology (Orlando, 2006).

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Список литературы включает 261 источников. Работа содержит 40 рисунков и 4 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ



1. Продукция зрелого гемолизина II при помощи секреционного аппарата E. coli



Гемолизин II был очищен из культуральной среды, выращенных при оптимальных условиях клеток E. coli Z85 (pUJ2) (Рис. 2А) с использованием эмпирической аффинной хроматографии. При подборе оптимальных условий бактериального роста и индукции (Табл.1) была обнаружена зависимость уровня продукции HlyII от температуры культивирования клеток E. coli Z85 трансформированных плазмидой pUJ2. Уровень продукции токсина определяли по гемолитической активности в культуральной среде и внутри клетки.

Табл. 1. Влияние условий культивирования на продукцию гемолизина II



рекомбинантными клетками E. coli Z85 (pUJ2)


Условия культивирования

гемолитическая активность, ГЕ/мл


18C

24C

37C

в присутствии ИПТГ


20

120

1

без ИПТГ

10

40

1
2014-07-19 18:44
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • Контрольная работа
  • © sanaalar.ru
    Образовательные документы для студентов.